成都华西华科研究所分析骨质疏松定量RT - PCR分析骨中基因表达与QCT骨密度软件体模检测

定量RT - PCR分析骨中基因表达 (Analysis of gene expression in bone by quantita­tive RT-PCR)

复合探针

荧光探针 淬灭探针

荧光探针

棋板

在骨中分离RNA进行RT- PCR分析骨中基因表 达具有很多闲难，骨中含有大里基质使得分离RNA十分 困难，另一方面冻存骨易碎研湃后可释放细胞内容物， Reno评价了 12种从骨中分离RNA的实验方案。因为 在大最基质有少里细胞、没有核糖体带、在Northern杂交 中不能检出看家基因GAPDH.DNA和蛋内污染，产生难 溶性RNA等因素，基于两种试剂盒发展了 Trispin方法， 在液氮中将伢研磨成粉末后提取RNA,可用于RT~ PCR分析骨中基因表达。

在骨中分离RNA进行RT-FCR可分析骨中基因 表达，聚合醻链式反应（PCR)可对特定基因进行扩增，因 此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊 断等领域。早期最成功及普及的应用领域是获取某一目 的基W,用于基因诊断有许多甸限性，主要有两点，一是 不能准确定里；二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假 阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交 法、克争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直 到最近焚光能童传递技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET)应用于PCR定贵后上述问题才得到较 好地解决。FRET是指通过供受体发色团之间偶极-偶 极相互作用，能黴从供体发色团转移至受体发色团，转移 效率与两个发色团之间距离的6次幕倒数成比例。 FRET在结构生物学，生物化学及距离测定的多学科内 有广泛的应用价值。

复合探针的基本质理如下：如图35-3所示，复合探 针由两个探针构成，一娃荧光探针，与靶序列互补，长27 个核苷酸，端接一荧光分子，3'端带一磷酸分子；一是 淬灭探针，能与荧光探针5'端杂交，长15个核苷酸左右， 3'端接一淬灭分子。当两探针结合时荧光探针发出的荧 光被淬灭探针吸收，溶液中没有荧光产生；当两探针分离 时荧光探针发出的荧光不再被淬灭探针吸收，溶液中即 有荧光产生。PCR扩增时当溶液中没有模板时，两种探 针特异结合，溶液没有荧光产生；当溶液中有模板时在较 高温度下荧光探针优先与模板结合，从而使两探针分离 产生荧光，荧光强度与溶液中模板数最成正比，以产生门 植荧光的循环数(CT值）对标准品浓度作图，据此可进行 PCR定貴测定。由于PCR扩增过程中可能存在的后期 循环抑制（late cycles inhibition)现象即平坦斜率和早期平

图35-3复合探针荧光定量原理 R:报告孳团；Q:碎灭基团；B:复钠組断基闭

(一）  材料

1.  RNA提取（见注意亊项1)研磨冰冻样品的研磨 机，消毒的解剖刀、剪子和#钳，提取核酸35mm直径的 组织培养皿，TRIZOL。

2.  RNA纯化和定ft 氣仿，SV RNA提取试剂盒， Sephadex分离柱,2M醋酸钠，乙醉，分光光度计。

3.  引物设计引物设计软件

4.  制备模板 PCR仪，引物，TA克降试剂盒，DNA 纯化试剂盒，SP6/T7RNA聚合酹，mRNA纯化柱，分子探 针

5.  实时荧光定量基因扩增检测试剂盒，引物，荧 光探针，荧光定里PCR试剂食。

(二） 方法

[16]    研磨骨组织

(1)可用研钵或研磨机在液氮中将骨研磨成粉末

(见注意亊项1)。

(2>将粉末转移至2mlEppendorf离心管（Ep管）内, 加人1.5〜1.75mLRNA提取缓冲液后，来回翻转离心 管混勻样品，在冰浴中放霣（见注意事项2、3)。

[17]    RNA提取

[32]    将上步溶液0.8mL转移至装有200；iL氣仿的 Eppendorf 离心管（Ep 管）。振摇 15sec。

[33]    放置 3 min 后在 4t：中离心（10 〇〇〇g,15min)。

[34]    吸取上层水相约5(HVL于另一装有20(VL95% 乙醉的Ep管内，来回翻转离心管4次。

[35]    将上述液体转移至mRNA纯化柱内，按要求纯 化mRNA,加100扎无核酸酶水在纯化柱内。

[36]    用一 Ep管内接在纯化柱下。

[37]    将RNA加在用无核酸酶水平衡的NAP -5柱内，当所有液体进入凝胶内，加lmL无核酸觴水洗 脱，每lOOpL收集。

[38]    测定RNA在260nm和280nm处测定吸收度的 比值，也可用凝胶电泳鉴定纯度（见注意亊项4)。

[39]    合并RNA部分，用1/1〇体积3M的醋酸钠和2 倍体积的95%乙醉沉淀RNA。

1.  在-20T:中放詈过夜或在冰浴中放a lOmino

2.  在 4C 中离心（10 000〜12 000g,15min)。

(11〉用冷的75%的乙醉重悬沉淀，离心沉淀

(10 000g,5min),吸弃上淸。在空气中干燥3~5min,注 意不要将沉淀干燥。

6.  根据沉淀体积用DEPC水溶解沉淀。在_ 80X：以下储存。

[18]    引物设计和RT-PCR

[40]    从数据库中找出兴趣cDNA序列。

[41]    得到cDNA对应序列并标出外显子之间的 边界。

[42]    将cDNA序列拷W到引物设计软件内₉

[43]    用程序标出外显子之间的边界。

[44]    在外显子之间设计探针序列，Tm值在70C ,按 要求设计探针,C碱基应比G碱基多，在5'端不含G碱 基，探针序列与PCR产物的一条序列互补。

[45]    按缺失参数设计引物。在y编的5个碱基中低 于3个A/T碱基也可以。

(7>如结果不满意，可在另外外显子之间设计探针 序列。

(2)    引物设计后KT-PCR可得到300〜500碱基长 的PCR产物，如果进行基因克降应在引物上加上觭切

位点。

[19]    内在质控

[35]      目的RNA的PCR产物做为模板。

[36]      将PCR产物克隆到pCRlI -TOPO栽体中并检 测插入位点。（见注意事项5)

[37]      将质粒线性化。

[38]      PCR 扩增。

[39]      用不含DNA酶的RNA酶处理样品可除去 DNA〇

[40]      用 RiboGreenTM 试剂定M RNA。

[20]    荧光实时定里PCR

(4)  用Gene Amp 5700软件在目录下建立新文件， 用标准品进行相对或绝对定擞（见注意亭项6)。

(5)  用不含KNA酶的水稀释体外转录的mRNA。

(6)  准备质控和样品反应的引物、探针和碱基混合 物•（见注意亊项7)

(7)  将质控和样品反应的RNA体系加人到上述中。

(8)  盖上96孔板，将其放在定量PCR的托盘中，运 行程序。

(9)  运行完程序后，检測曲线显示荧光强度与循环 数的曲线图，设罝基线，调整Y轴幅度，在线性范围中间 选抒阑值。

(10)      编辑标准曲线给出线性范围（见注意亊项8)。

(11)      用响应程序产生试验报告。

(9>用质控产生试验报告（见注意亊项9)。

(10〉用样品反应的RNA与质控RNA的强度比值 进行数据归一化。

3.  计算标准偏差。

(12〉用样品反应的RNA与质控RNA的强度比值 作为试验终数据。

7.  用/检验进行数据统计。

[45]      注意事项

(1)  仪器准备所用器械在180X：干烤8h灭活 RNA酶并用铝箔包适包裹。

(2)  #样品大小骨样品应小于500mg。

(3)  粉碎组织确保骨样成为粉末，如釆没有，则钾 换研磨盏，用液氮冷却组织和容器，在最大转速研磨 2min，已加人TRIZOL或PIG-B,这些试剂可能会凝固， 可在室温融化并放置5rni_n,确保核酸和蛋白分离。

(4)  RNA在260nm和280nm处测定吸收度的比值 在1.8〜2.0内则纯度较好。

(5)  内在质控的克隆我们将PCR产物到pCRII - TOPO载体中并检测插人位点，其它栽体或PCR策略也 可制备体外转录的mRNA,可用基因测序或_切检奄插 入位点。

(6)  用Gene Amp 5700软件编辑标准曲线给出线性 范围定里标准品建立标准曲线。

(7)  避免PCR污染用非模板质控检测污染。在 PCR整个过程中推荐在层流柜内操作。根据mRNA的 不同决定质控和样品反应的重复次数，相同样品的重复 可给出梢密度。

(8〉PCR抑制剂的影响从骨中提取的RNA含有 PCR的抑制剂，可将样品稀释戚少影响。

(12)      选择质控RNA质控RNA通常选择看家基因 如:3-GAPDH, p-actin 或核糖体 RNA。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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