成都华西华科研究所分析体内糖尿病检测与糖尿病早期无创检测诊断方法

本发明涉及用自身反应性物质产生一种用于诊断影响免疫系统的细胞 介导的疾病或细胞介导的疾病的体质的物质。

近年来，对诸如类风湿性关节炎和少年糖屎病（IDDM )这类自身免 疫性疾病的产生过程中的分子关系的解释已有了迅速的进展，而且已经出 现了对这类疾病的早期诊断和随后的治疗的具体的应用.

目前已经证实，在这类疾病的产生过程中，除了遗传的疾病体质外， 环境因素也起了一定的作用。在遗传的危险因素方面，例如在IDDM中， 只有MHC II型抗原的一些等位基因与这类疾病密切相关。因此可以通过 分析这些等位基因而为IDDM定义一个易感人群(如参见Thomson等人， J.Hum. Genet. 43 (1988)，⁷99-816 或 Todd 等人，Nature 329 (1987)，599- 604 )。

在IDDM产生过程中的环境因素可能是外源的免疫原性的活性肽序 列。在这方面已经对病毒抗原进行了讨论，它们与内源性结构有部分同源 性。在特殊情况下，尤其是在出生后的一段时间，通过食物而被吸收的抗 原如牛血清白蛋白能够引起免疫反应，由于与内源性结构的同源性，这种 反应会引起一个自身攻击性的过程。

在IDDM中的发病过程中，典型的现象就是由细胞毒性淋巴细胞引起 的胰脏p细胞的逐渐破坏。这一过程远远早于葡萄糖代谢被破坏这一现象变 得明显之时。当糖尿病的症状可被检测到时，80 %以上的p细胞已经被破 坏了.因此，在较早的时期在易感人群中检测到这些自身攻击性T细胞就 显得十分地重要，这样就能够为被感染的人提供及时的治疗„

目前已经证实，在自身免疾性疾病中，内源性组织的破坏在开始时进 行得十分缓慢•在这一过程的开始阶段，自身攻击性T细胞可能只识别一 种或几种自身抗原。在Kaufman等人(Nature ³⁶8 (1993)，69-72)和Tisch 等人（Nature 368(1993)，⁷2-⁷8)的报道中，I型糖尿病的动物模型（NOD小鼠）显示，当这种小鼠自然发生糖尿病时，初始的T细胞介导的自身免 疫反应是针对谷氨酸脱羧酶的。在该过程的初始阶段，在NOD小鼠体内只 在谷氨酸脱羧酶（GAD )的C _末端识别1至2个表位。上面已经提到， 葡萄糖代谢的改变在这一阶段还不能被检测到，而此时perinsulitis已经能 够被检测到了。只有当疾病进一步发展时，通过自身攻击性T细胞来识别 的GAD的肽的谱才能变得更宽。一旦糖尿病已经明显，也就可以检测到预 先活化的T细胞，它们对抗其它的岛细胞抗原，例如外周蛋白、热激蛋白 HSP65和羧肽酶H。

有证据表明，在人中针对GAD的免疫反应也与I型糖尿病的产生有因 果关系。因此举例来说，在大约80 %的前期糖尿病中可以检测到针对GAD 的自身抗体，尽管人们估计这些自身抗体不是主要的病原。而且有人推测 在I型糖尿病中T淋巴细胞对胰脏p -细胞有逐步破坏。已经有一些研究 小组（Harrison 等•，J. Clin. Invest. 89 (1992)，1161; Honeyman 等•，J. Exp. Med. 177,（1993)，535)检测到了针对GAD的上述T淋巴细胞。这些 小组发现的T淋巴细胞与GAD67kd分子的肽片段反应，该片断含有氨基 酸 208 至 404。

EP - A _ 0519 469公开了得自人〇八〇651«1分子的自身免疫反应多 肽。这些多肽的氨基酸序列如下：

X P E- V K - (T 或 E) K Z

其中X是从1至10个氨基酸中选出的一个任选序列，Z是从1至8 个氨基酸中选出的一个任选序列。

欧洲专利申请号95 100 7640中也提出了得自人GAD 65的自身反应 肽序列以及一种含有这些肽的药物组合物„该申请还描述了使用这种药物 组合物来产生一种物质，该物质被用来诊断影响免疫系统的疾病或疾病体 质，或用来诊断肿瘤疾病或肿瘤疾病的体质。

本发明的目的之一是提供一种用于免疫系统的细胞介导的疾病，特别 是自身免疫性疾病的诊断方法，该方法一方面尽T能地减少病人的不适 感，另一方面能够进行快速和可靠的诊断。

该目的是通过用自身反应性物质产生一种用于珍断细胞介导的疾病或 细胞介导的疾病的体质的物质实现的，其中该物质被皮内给药，诊断依据是在给药部位是否出现阳性反应。

本发明的诊断方法与目前市场上可得到的方法不同，目前使用的方法 被用于细胞介导免疫的一般性检测，不同之处在于，这些检测使用了病人 已经接触过的外源性抗原，例如纯化的蛋白质衍生物（PPD )、破伤风类 毒素、念珠菌属（Candida )等。这些检测被用于确定被检测者的免疫系 统的一般状态。免疫系统的细抱介导病没有被检测

在另一个被广泛用来确定变应性反应的检测，例如穿刺(prick)检测 中，抗原不是在皮内给药。不是由T细胞介导的阳性反应可以在四小时内 被检测到，其特征是表面出现肿胀，而不是出现结节。

本发明提供了一种用于在体内检测针对自身反应性物质的细胞介导免 疫反应的发生的方法。这种细胞介导免疫反应显示了免疫系统的特定疾 病，特别是自身免疫性疾病或这类疾病的体质的存在。另外，细胞介导免 疫反应还显示肿瘤疾病或其体质的存在„

适合于本发明方法的自身反应性物质或自身抗原是天然、合成或重组 物质，例如核酸、脂类、糖类、多肽、蛋白质、肽类以及它们的复合物， 例如肽与诸如MHC分子或肽结合衍生物这样的多肽所形成的复合物。另 外的合适的自身反应物质是特定的免疫原性表位、片断、类似物、拟形物 或例如通过化学修饰而产生的衍生物以及上述这些物质的混合物。可将自 身反应性物质原样给药或以载体结合形式给药，例如以脂肽形式给药。自 身反应性物质可被单独给药或与附加的物质，例如附加的刺激组分或佐剂 一同给药。通过重组DIVA技术或例如肤的固相合成的合成方法，可以由天 然来源制得自身抗原。

在内源性抗原方面，除了自身反应物质外，还可以使用那些尽管是外 源性抗原但与自身抗原有免疫学关系的自身反应物质。这类外源抗原的例 子就是与得自内源性蛋白质的自身反应性肽序列有同源性的肽。具体的例 子有：具有序列L - V - Y - P - G P - I - P- N (氨基酸60 - 68 )的得自牛p _酪蛋白A的肽，它与内源性葡萄糖转运蛋白GLUT - 2 在序列 Q - I - G _ P-G P-I-P - W (氨基酸 412 _ 420 )区 域中有同源区的部分；具有序列K-V-[_I-L- P _ E - V - K - E - K - H - E (氨基酸33 _ 45 )的得自柯萨基病毒蛋白质P2 - C

3的肽，它与谷氨酸脱羧酶在序列R-F -反-M- F - P - E - V - K -E ~ K - G - M (氨基酸155 - 167 )区域中有同源性。

本发明的方法包括将不同的自身抗原在皮内给药并确定在给药部位是 否发生局部的阳性细胞反应•该阳性反应在T细胞介导的免疫反应所特有 的时刻进行确定，其确定时间优选是在给药至少24小时之后，更优选是在 给药后的24小时至1周之内，最优选是在给药后的40 _ 80小时之间。

阳性反应优选地包括在给药部位出现肿块，可以通过目测或/和触诊对 其进行定性确定，也可以通过诸如超声波或照相的方法对其进行定量测 定。

在另一方面，还可以确定阳性反应的产物，例如诸如y-干扰素的细胞因 子，它是由诸如白细胞的浸润细胞在给药部位释放的。

本发明的方法尤其适合于诊断自身免疫性疾病或自身免疫性疾病的体 质。

举例来说，可用本发明的方法诊断的自身免疫性疾病有糖尿病，尤其 是I型糖尿病（IDDM )、多发性硬化、类风湿性关节炎、巴西多氏病、 类风湿性脊柱炎、急性前眼色素层炎、Good- pasture综合征、重症肌无 力、系统性红斑狼疮、寻常天疱疮、免疫甲状腺炎、硬皮病、克罗恩氏病、 Sjogren综合征、莱特尔氏综合症、肠炎或Graves病。本发明的方法尤其 优选地用于诊断T细胞介导的疾病，例如IDDM、类风湿性关节炎或多发 性硬化，本发明的方法最优选地用于诊断IDDM。

举例来说，用于诊断IDDM的自身反应物质有谷氨酸脱羧酶（GAD ) 65kd或67kci、絡氨酸嶙酸酶（38kd的抗原）、羧肽酶H、胰岛素、热 激蛋白、38kd的胰岛素分泌颗粒蛋白质或其部分。人GAD 65kd或它的部 分肽序列被更优选地用作自身反应性物质。

然而类似的诊断也可用于其它的自身免疫性疾病。这类自身免疫性疾 病的例子有：多发性硬化，其中可以检测到对抗髓鞘碱性蛋白质或蛋白脂 质蛋白质等的反应性T细胞；类风湿性关节炎，其中可以检测到对抗II型 胶原、细胞角蛋白、得自大肠杆菌（E.coli )的dnaJ蛋白和Hsp 65的反 应性T细胞；巴西多氏病，其中可以检测到对抗甲状腺过氧化物酶的反应 性T细胞。在患重症肌无力时可以检测到对抗乙酰胆碱受体或其它有关的4自身反应物质的反应性T细胞。在患红斑狼疮时可以检测到对抗HSP90的 反应性T细胞，而在Graves病中则有对抗TSH受体的反应性T细胞。

总之，该诊断可以用于影响免疫系统的所有疾病，例如也可以用于动 脉硬化•在这种情况下，已经证实该病与对抗热激蛋白Hsp65的免疫反应 有关（Xu 等人，Lancet 从1，8840 (1⁹9³)，2⁵⁵_2S9)。

一个更进一步的应用是诊断性地检测与肿瘤抗原反应的T细胞。例如 检测对抗与黑素瘤有关的抗原MAGE1的T细胞，该T细胞分离自黑素瘤 患者(van der Bruggen 等人，Science ²⁵⁴ (1"1)，1⁶⁴³_1⁶⁴⁷)。在用传统的 方法还不能检测到肿瘤（由于细胞物质还太少）之前就可以检测到这些T 细胞了。另外，特异性反应性T细胞还可被用于监测一种抗肿瘤的疫苗接 种。

另外，使用肽、肽的衍生物或类似地结合的分子作为自身反应性物质 也是可能的《为了诊断IDDM，优选地使用一种或几种得自GAD、尤其 是得自人GAD 65kd的肽，或者由其衍生的肽衍生物或肽拟形物。

为了诊断IDDM，十分优选地使用含有如下氨基酸序列的肽或肽衍生 物：

(g)     氨基酸序列（vii)

F-F~R-M^_V-I—S-N-P-A-A^-T—H—Q-D-I-D-F-L-I,

(h)    氧基酸序列（VIII)

G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A,

(i)      氨基酸序列^（1幻

E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K,

⑴示于图1或图2的氨基酸序列中的一个，

(k)    长度至少有6个氨基酸的示于(a)至⑴中的氨基酸序列的部分区域， 或/和

(l)      与示于(a)至⑴中的氨基酸序列有基本上相同的对MHC分子的结合 特异性或/和亲合力的氨基酸序列。

氨基酸序列（I )至（VII )相应于人GAD65kd的氨基酸残基86 _ 105 ( I )、246 - 265 ( II X 146 - 165 ( III )、166 - 186 ( IV X 176 _ 195 ( V )、206 - 225 ( VI )和 556 - 575 ( VII )。在序列 SEQ ID NO.l - 7中对氨基酸序列I - VII进行了陈述。

氨基酸序列（VIII )相应于人GAD 65kd的氨基酸残基266 - 290, 氨基酸序列（IX )相应于人GAD 65kd的氨基酸残基306 - 325。示于图 1和2中的氨基酸序列也是人GAD65kd的部分序列。在序列SEQIDNO.8 - 28中给出了图1和2的氨基酸序列。在序列SEQ ID NO.29和30中给 出了氨基酸序列（VIII )和（IX ) »

人们惊奇地发现，含有人GAD 65上述区域的肽与从最近发现的I型 糖尿病中分离出来的T细胞亚群发生特异性反应。因而本发明中的肽是早 期的自身表位，它的应用使对I型糖尿病的极早期的诊断成为可能。

氨基酸序列（I )至（IX )是得自人谷氨酸脱羧酶（GAD )的65kd 的同型物的部分区域，GAD冗整的氨基酸序列描述于Bu等人（Proc. Nat. Acad.SciUSA 89(1992)，2115ff.)的文章中。氨基酸序列（I )至（IX ) 是这样被发现的，即先建立得自I型糖尿病的外周血的T细胞系，然后在 体外用得自猪脑的GAD或用重组的人GAD刺激它们并在增殖检测中用得 自人GAD序列的合成肽序列检测这些T细胞系。

6可以通过使用化学方法的已知合成过程来生产这些肽，也可以通过基 因工程来生产，基因工程方法是在一个合适的宿主细胞，尤其是大肠杆菌 (E.coli )中克隆并表达编码这些肽的DNA序列。

具有特定的（I )至（IX )的氨基酸序列或示于图1和2中的氨基酸 序列的部分区域的肽也是优选的，其长度至少为6个氨基酸，优选为至少8 个氨基酸，更优选为至少10个氨基酸，最优选为至少15个氨基酸。本发 明的氨基酸的最小长度是通过它识别MHC分子、与该分子特异性地结合 以及与相应的T细胞受体反应的能力来确定的。

得自GAD并与MHC结合的本发明肽的部分的最大长度优选为100个 氨基酸，更优选为50个氨基酸，最优选为25个氨基酸。

除了上述的肽外，也可以使用与上述的肽序列有基本相同的对MHC 分子的结合特异性或/和亲合力的肽，它们优选地得自上述的氨基酸序列， 方法是对不同的氛基酸残基或对氣基酸残基的一小部分或对以类似方式结 合的修饰后的物质进行取代、缺失或插入。

特别地，本发明还涉及肽的变种，它们的序列与上述的氨基酸序列不 是完全相同，而是只含有相同或密切相关的“锚位”。术语“锚位”是指 一种对于与一种MHC分子，尤其是与DR3、DR4或DQ类的MHC分子 相结合必不可少的氨基酸残基。举例来说，Hammer等人在Cell 74 (1993)，197 _ 203中对用于DRB10401结合基元的锚位进行了陈述。这 类锚位被保留在本发明的肽中或被具有在化学性质上密切相关的侧链的氨 基酸残基所取代（例如缬氨酸取代丙氨酸，异亮氨酸取代亮氨酸，反之亦 然存在于本发明的肽中的锚位可以用一种简单的方式测定，方法是检 测上述特定肽的变种与MHC分子的结合能力。本发明的肽的特点是它们 具有与上述的肽基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲和力。与初 始的肽或其部分序列相比，得自这些肽的肽优选具有至少30 %的序列同源 性，更优选为至少50 % ,最优选为至少60 %。特定的肽的变种的例子有得自人GAD 67的相应的同源肽部位，Bu等 人也对其完整的氨基酸序列进行了描述，同上文。

“基本相同的对MHC分子的结合特异性或/和亲和力”这一概念也包 括一种与（I )至（VIII )的氨基酸序列相比或与示于图1和2中的氨基

7

酸序列相比得到了提高的结合特异性或/和亲和力，这尤其多见于长度优选 为8至15个氨基酸的缩短的肽中。

本发明还涉及肽的衍生物。这一术语包括那些其中一个或几个氨基酸 已经被化学反应所衍生化了的肽。本发明的肽衍生物的例子尤其指这些分 子，即那些主链或/和反应性的氨基酸侧基，例如自由氨基、自由羧基或/ 和自由羟基已经被衍生化了的分子。氨基衍生物的具体例子有磺胺类或羧 酰胺、硫代氨基甲酸乙酯衍生物以及铵盐，例如氢氯化物。羧基衍生物的 例子有盐类、酯类和统胺类。羟基衍生物的例子有〇-酰基或〇-烷基衍 生物。根据本发明，肽的衍生物这一概念还包括这样一些肽，其中的一个 或几个氨基酸被与20个“标准”氨基酸为同系物的天然存在或非天然存在 的氨基酸所取代。这些同系物的例子有4 -羟基脯氨酸、5 -羟基赖氨酸、

3 _甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、p _丙氨酸和4 -氨基丁酸„

另外的合适的肽衍生物是肽和辅剂组分之间的络合物或共价键，它们 与诸如脂类的自身抗原被一同给药。在这种情况下，肽也可以被用作脂肽。

本发明还包括多肽，其中结合MHC的肽部位是一个更大的多肽单元 的组分，其中结合MHC的肽与多肽单元的残余部分之间的连接处优选有 一个事先确定的断点，例如一^个蛋白醉切位点^

本发明还涉及肽拟形物，它们与上述的肽或肽的衍生物有基本相同对 MHC分子的结合特异性或/和亲和力。就其与MHC分子的相互作用而言， 肽拟形物是可以取代肽的化合物，而且与天然的肽相比，它们有更高的代 谢稳定性、更好的生物可获得性和更长的作用持续性。制备肽拟形物的方 法描述于 Giannis 和 Kolter，Angew. Chem. 105 (1993)，1303-1326 ; Lee 等 人，Bull. Chem. Soc. Jpn- 66(1993)，2006-2010 以及 Dorsch 等人， Kontakte (Darmstadt) (1993)(2)，48-56。就本发明的肽拟形物的制备而言， 参考了这些文献中公开的内容。

一种更合适的自身反应性物质是一种复合物，它包含至少一种肽、肽 的衍生物或肽拟形物以及至少一种MHC分子或一种MHC分子的肽结合 衍生物《在这种复合物中，结合常数优选为至少l〇^_7|/mol、更优选在10 ^{_ 8}10 ^{_ 9}l/mol之间的肽、肽的衍生物或肽拟形物与MHC分子或MHC分子的肽结合衍生物相结合。另外，肽、肽的衍生物或肽拟形物也可以通过

8光接头与MHC分子共价结合，或者是共价的遗传性肽-MHC融合体》 这种肽-MHC融合蛋白质优选含有一种HLA - DRp链以及一种与其遗 传性地融合的自身反应性肽。这种复合物更优选地含有II型MHC分子或 其肽结合衍生物。

编码II型MHC分子的基因的核苷酸序列参见CoreH等人（Mol. Immunol. 28 (1991)，533-543)。该文献被包括在本发明的内容中。

“ MHC分子的肽结合衍生物”这一概念包括MHC分子的片断，它 们是通过对天然MHC分子的蛋白水解酶切或通过重组DNA技术来制备 的，而且它们基本上保持了它们的肽结合特性。也可以将这一概念理解为 包括融合蛋白质，其中除了含有负责结合肽的MHC部分外，还含有其它 多肽组分„

肽-MHC复合物的制备优选是通过将不含肽的MHC分子或MHC 分子衍生物与本发明的肽、肽衍生物或肽拟形物相结合而实现的。举例来 说，不含肽的MHC分子的制备是通过伸展天然MHC分子以解离结合的 肽并使空MHC分子重折叠而实现的（参见Dornmair and McConnell，Proc. ^3认人€3(1.8吐118八87(1990)，4134-4138 以及\¥〇91/14701 ^其它用于 制备肽和MHC分子的复合物的方法描述于欧洲专利申请NO.95 100 764.0 中„该文献被包括在本发明的内容中。

本发明还涉及一种组合物在一种诊断方法中的使用，该组合物包括一 种作为活性成分的自身反应性物质，例如蛋白质、多肽、肽、肽的衍生物、 肽拟形物或/和肽-MHC复合物，它们选择性地与佐剂或其它通常的药物 添加剂相组合，该方法包括将这种组合物在皮内给药。该组合物还可以含 有一种附加的刺激组分，例如诸如IL - 2和IL - 4或/和表面抗原B7的 细胞因子（参见 Wyss-Coray 等人，Eur. J. Immunol. 23 (1993)，2175-2180; Freeman等人，Science 262(1993)，909-911 )，该刺激组分可以结合在T 细胞的表面分子CD - 28之上。这种附加的刺激组分的存在可以改进或/ 和改善该组合物的诊断效果。

另外，在本发明的方法中进行具有阳性或/和阴性对照的附加的检测也 是优选的。例如，可以使用一种不反应的多肽，例如人血清白蛋白，或者 只含添加剂的制品，例如缓冲液作为阴性对照„例如，得自培养了瘤细菌

9的培养基的纯化后的蛋白质衍生物（例如购自Statens Serum Institute， Copenhagen Denmark )或已知在许多人中可以导致强烈的T细胞刺激的 破伤风类毒素可以被用作阳性对照抗原。

在本发明的某些实施方案中，将自身反应性物质与一种佐剂一同给药 也是优选的••合适的佐剂的例子有氢氧化铝、不完全弗氏佐剂，磷酸铭以 及适合于与肽连接的脂类（脂肽）。

自身反应性物质可以通过已知的方法给药，例如使用具有大小为26G 针头的一般的皮内注射器。含有自身反应性物质的组合物的优选的皮内给 药剂量为20^1至500jil，更优选为50^丨至200^1，给药的合适体位以使所 提供的自身抗原最便于达到免疫系统的细胞为准。例如为诊断IDDM，可 将该药注射进前臂（正面）。

在组合物中的自身抗原的浓度可以根据各种情况下所使用的自身抗原 在一个很宽的范围内变化。1至l〇〇pg/ml的浓度，尤其是5至2pg/m丨的 浓度是优选的。

另外，也可以在一台装置中进行给药，该装置包含一个用于存储含有 自身反应性物质的制剂的容器、一个用于存储阳性对照制剂的容器以及一 个用于存储阴性对照制剂的容器。举例来说，该装置可以包含2到10个用 于存储含有自身反应性物质的制剂的容器••可以以一种简单的方式使用该 装置以便同时检测许多自身反应性物质„

本发明的另一主题是确定一种特异性T细胞亚群，其中含有T细胞的 样品与自身反应性物质相接触，而该样品优选地得自给药部位的组织样 品，然后测定T细胞与自身反应性物质的反应。举例来说，T细胞与自身 抗原的特异性反应可以通过T细胞繁殖的增加来检测到，而繁殖的增加可 以通过放射性的掺入而加以测量。在另一方面，T细胞的反应也可以通过 使用一种被标记了的自身抗原来直接检测，例如该自身抗原与可溶性的 MHC分子以复合物的形式存在。在这一实施方案中，自身反应性物质优选 地是与连接在其上的荧光标记基团一同使用。举例来说，可通过FACS分 析来进行评价，其中T细胞与连接有T细胞特异抗体的第一个荧光标记物 相接触，然后与连接有第二个荧光标记物的自身抗原相接触，然后通过荧

光显影分析法来确定双重标记细胞的存在。以这种方式就可以确定一个T

10细胞亚群，其特征就是它与一种自身抗原的反应性。该方法还可以选择性 地包括对预先活化的T细胞的选择，例如通过与IL - 2的培养或/和通过 与IL _ 2受体抗体的培养、随后例如使用免疫-磁方法对抗体结合细胞的 分离来选择性地富集IL _ 2受体-阳性T细胞，在另一方面，在T细胞与 自身抗原接触后，可以首先选择预先活化的细胞。

在对该方法的一个修正中，还可以确定预先活化的自身反应性T细胞 (具有作为表面标记的IL - 2受体的T细胞）与没有活化的自身反应性T 细胞（没有IL - 2受体的T细胞）的比率》

本发明的另一主题是分离与一种自身抗原反应的T细胞亚群。在该方 法中，取自给药部位的含有T细胞的组织样品与一种自身抗原相接触，然 后识别这些与自身抗原反应的T细胞并选择性地将它们与其它的T细胞分 离。在这种情况下，在T细胞与自身抗原接触之前或/和之后，也可以对预 先活化的T细胞，即含有IL- 2受体的T细胞进行选择。在该方法中，举 例来说，可以以下列形式使用自身抗原：自身抗原与MHC分子形成的复 合物、自身抗原被固定化在载体上，这就简化了将阳性反应的T细胞群与 其它T细胞分离的过程。通过重新刺激，从以这种方式分离出的T细胞亚 群中可以建立起T细胞系。然后就可以使用这些自身反应性T细胞系使病 人免疫。

在用于识别特异性T细胞亚群的诊断方法中，也可以使用一种抗独特 型抗体来代替自身抗原，该抗体模仿了 MHC肽复合物的作用。通过把对 一个特定的抗原有特异性的T细胞亚群用作生产抗体用的免疫源（例如在 小鼠中），或通过首先产生一种对抗自身抗原的第一抗体，然后再产生一 种对抗第一抗体的抗独特型抗体，就可以很方便地得到上述抗体。

通过识别这些在体内被激活的T细胞的产物而不是分离这些T细胞， 也可以识别特异的T细胞亚群。这可以通过收集组织样品（例如精细的针 吸出物）并测定其中所含的细胞因子来实现。另外，也可以原位测定细胞 因子，方法是使用一种长效药膏，其中固定化有针对各种细胞因子的抗体。 通过一种传统的固相免疫分析法来检测细胞因子，其中使用了酶底物，它 可以产生一种不溶性的有色产物，该产物可被直接读取或使用扫描仪读 取《

最后，本发明涉及一种试剂盒，它用于在体内诊断细胞介导的疾病或 这种病的体质，其中包括：

a)      至少一种以可接受的药物组合物形式存在的自身反应性物质，

b)      任选的至少一种以可接受的药物组合物形式存在的对照物质，

c)      用于自身反应性物质和对照物质的皮内给药的装置，以及

d)      任选的用于对检测结果的诊断性评价的装置。

用于自身反应性物质以及对照物质的组合物中优选地含有佐剂并且可 选择性地含有其它普通的药物载体物廣、稀释剂和添加剂。

与图1和2以及序列SEQ ID NO.l _ 30相结合的下述实施例是为了 进一步阐明本发明。

图1显示得自人GAD 65kd的自身反应性氨基酸序列，

图2显示得自人GAD 65kd的其它自身反应性氨基酸序列，

SEQ ID NO.l - 7显示得自人GAD ( I ) - ( VII )的自身反应性氨 基酸序列，

SEQ IDNO.8 _ 11显示得自图1中的人GAD的自身反应性氨基酸序列，SEQ ID NO.12 - 28显示得自图2中的人GAD的自身反应性氨基酸 序列，

SEQ ID NO.29和30显示得自人GAD ( VIII )和（IX )的自身反

应性氨基酸序列。

实施例1 (对比例）

体外试验

从8个最近感染了 IDDM的病人体内以及12个健康人体内收集外周静 脉血》通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，然后将其 与下述物质一起用于体外刺激：

a)      重组人GAD 65kd，作为检测抗原；

b)      纯化后的蛋白质衍生物（PPD )，作为阳性对照抗原；

c)      人血清白蛋白（HSA )，作为阴性对照抗原。

在上述抗原存在或只有培养基存在的条件下，在具有96个孔的圓底培

养器的1个孔内将1 ^x 10⁵个外周血淋巴细胞（PBL )在37 X：和5 % C0₂

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的条件下在lOOpl的培养基内培养五天（RPMI 1640培养基，5 %人血 清，2mmol/l谷氨酸胺，10U/ml青霉素，10|ig/ml链霉素和50nmol/l 2

-巯基乙醇）。

5天以后，向每一个孔内加入20|i丨含有0.5pCi3H胸苷的RPMI1640

培养基。继续培养16小时，然后收集细胞。通过液体闪烁计数计量胸苷的 掺入。将结果作为刺激指数（SI，即用抗原存在时的cpm除以抗原不存在 时即只有培养基存在时的cpm ) „

得自IDDM病人和对照组正常人的淋巴细胞针对不同的抗原的繁殖反 应结果被列于表1和2中。

表1

		SI=被刺激的PBL，cpm/未被刺激的PBL，cpm
IDDM 病人	基值，cpm	PPD 10|ig/ml	rhGAD 65 10 卩 g/ml	HSA 10|ig/ml
1	730	17.9	2.6	1.1
2	833	16.7	8.8	1.2
3	639	23	6.6	0.9
4	328	28.9	0.8	2.9
5	1211	10.6	1.9	0.5
6	1041	11.9	1.8	2.2
7	520	19.8	7.2	1.0
8	412	2.7	8.3	0.8

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成都华西华科研究所研发生产多种糖尿病及并发症早期无创检测诊断系统

研发生产无创糖尿病及并发症早期检测诊断仪

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