成都华西华科研究所分析成骨细胞培养模型与QCT骨密度软件体模检测

成骨细胞培养模型（Culture mode丨of os­teoblast 1

(一）培养细胞来源

1.原代培养

(1)来源于颅骨或成熟骨自胚胎或新生动物颅骨 (calvariae)分离培养成骨细胞是经典的成骨细胞堉养模 型。这些幼体组织细胞能在体外迅速的增生，并在相当 一段时间内保持具有活性的成熟成骨细胞表逛。在实际 搡作中颅骨较其他部位骨容易被分离并保持无菌状态， 扁骨中较少骨髄，解剖颅骨时亦可注意切除软骨区，从而 最大限度地减少成骨细胞培养中其他细胞的污染。

颅骨来源的成骨细胞常取自胚胎或新生的小鼠％或 大鼠亦有取自鸡W和牛^[5]。用胶厣蛋白酶和胰蛋白 酶等蛋白酶来对组织进行消化是最常用的细胞分商方 法。采用比重分离或在消化过程中的不同时间点来收集 细胞的方法，可以获得大量的成骨细胞样细胞〇醃消化 法的具体方法是：①无菌条件下取下顶骨和额骨；②胶职 蛋白酶（I型：n哦= 1:3)消化4次，每次20min。其中胶 原蛋白酶活性第1次消化时为43 IU/mL,以后为每次 172 RJ/mL。第1、2次消化在室湿下进行，第3、4次时罝 37X：溢箱内；③收集第3、4次消化细胞，重悬于培养基 中，计数后种植于培养瓶内^:6]。鷗消化法也被用于从已

矿化的成熟钟中获得成骨细胞^:7]，包括从#内膜中消化 分离成骨细胞。

体外骨组织块培养也是从成熟骨中获得成骨细胞的 普遍应用的方法^[>0。#组织块多取自成年人骨活检或手 术标本，剪碎组织后，将骨髄中造血细胞和成纤维细胞采 用冲洗或酶消化方法去除，剩余组织块经一段时间培养， 细胞移出并附壁生长。采用这种方法获得细胞较酶消化 法用时长，但对细胞的损伤比较小。

(2)来源于骨髄骨髄基质细胞典有向多种成熟功 能细胞分化的潜能〇在一般培养条件F，来源于多种种 属（包括人、大鼠、小鼠、兔、狗笄）的骨髄细胞经附荦坫 养，可以增殖成为纤维母细胞。在低密度接种培养时，这 些细胞形成纤维母细胞样集落形成单位（colony forming unit, CFU广^]。CFU被认为具有成骨潜能^iw]。骨髄基 质细胞在含存血淸、地塞米松、VitC、p-磷酸甘油和较商 起始培养密度等条件下，可以体外分化成为具有形成骨 矿化结节能力的成熟成骨细胞。诱导分化主要步骤如 下：①以培养基G骨髄腔内冲刷洗出并收集细胞，离心 后，计数有核细胞并接种至坫养瓶（皿〉中；②在37t：， 5%(^条件以条件培养基培养细胞，每周史换半M 培养基两次；③一周左右观察，可见貼壁细胞商集，M扁 平和立方样形态，此时可以胰蛋白酶-EDTA消化，传代 培养细胞。

2.永久细胞系

(1)骨肉瘤细胞系最早被克降和被广泛应用的具 有成骨细胞特征的ROS细胞系来源于AC丨种系大鼠的 自发性骨肉熘ROS细胞系亚克隆ROS17/2.8稳定 表达成骨细胞特异性标志物如碱性磷酸酶、PTH受体、 骨钙索等.适苴骨相关基因转染，是研究成#细胞箪因表 型及其调节的理想模型。

UMR细胞系也来源于大鼠#肉楠^U21。UMR- 106 细胞表达成骨细胞标志物并发生矿化，曾用于cAMP信 号通路研究等多种基因转染研究。UMR细胞不表达骨 钙索，这是其有别于其他模型的主要局限。

若干人骨肉瘤来源的细胞系也被用作成骨细胞的模 甩。MG-63、Saos-2、Tt：-85 和 OHS- 4 等人骨肉榆 细胞均易被不间载体转染，虽然这些细胞只能分别表达 成骨细胞表型的某畤方面，但作为模型为研究成#细胞 转录调节元件、细胞因子和激素闲节机制等提供了方 便⑴）

U)非转化细胞系从啮齿类动物正常骨组织克隆 建立的未通过基因转化的类成背细胞系亦被鉴定和用于 部分研究。MC3TT3- K丨细胞是这一类中具有代表性的 克降系^[M]。MC3T3-E1来源于iH常小鼠颅盖骨，是在 培养过程中碱件磷酸酶商表达的细胞种群，在无外源性 有机磷酸盐条件下培养2~3周后培养中可出现矿化结 节。另外，MC3T3-E丨细胞勻从颅盖背分离的成骨细胞 表铟相似，即在V期衣现为增生活跃，而在细胞丰富融合 后才表现出成骨细胞特征。已定哦或部分定型的非转化 细胞系还有来源于大鼠颅#的RCJ细胞^|5]、来源于大鼠

骨外膜的UMR - 201细胞…¹、来源于背髄基质的 MBA- 15细胞^:n)等。

1.  永生化细胞系采用猿病毒SV40的大T抗原 转染成骨细胞是产生永生化细胞系的主要方法。经转化 的永生化细胞系代表成骨细胞表型的不同时期，结合转 染某种射药基因或温度敏感基因可用于成骨细胞在某个 特定时期的转录机制或启动+调节等研究。用这种方法 迷立的细胞系包括来源于大鼠颅骨的两个细胞系 RCT- 1和RCT-3^(l81、来源于成人骨的HOB〖T^[l91和胎 儿骨的hFOB²⁰³等。其中hFOB细胞在允许温度（33. 5X：)时迅速增飱而在非允许温度（39.5X：)时增殖停止， 在此期间表达多种成骨细胞特异性标志，包括基质蛋d 基因和在PTH作用下的cAMP蓄积。hFOB细胞在非允 许温度时仍有碱性磷酸酶表达和对维生素D的应答反 应。

(二）   培荞体系选择

用于研究成骨细胞的细胞培养体系有很多种，主要 分为由刚从组织分离或有限传代的原代细胞培养，和已 建立的永久细胞系。

水久细胞系的优势在于其能持续保持细胞表沏，可 提供较大数M细胞用于各种生化分析或细胞核酸提取。 其局限性在T由于长时间体外培养，细胞在保持其体内 原塱的同时，可能发生适应体外环境的衣型变化。另外， 永生化本身也会产生自主的或实验条件诱导的细胞生长 行为和表型表达变化。细胞克隆有4能是建立永生细胞 系过程的一部分。克降的优点是即使经过长时间连续培 养，一个细胞种群的表型仍可追溯到那个种群起始细胞。 衍是，克隆得来的细胞的表型也〇丨能存在不同源性，或者 随畚时间的延长发生表甩偏移。W此，在应用克降细胞 系时应注意定期检査细胞表型。

原代细胞培养由于应用即时分离细胞进行短期培 养，细胞因突变、细胞老化和过度增生而引起表型改变的 机会较少，因此被认为较好的反映r细胞在体内的特性。 应用酶消化方法得到的细胞可能包含史多的较成熟成骨 细胞，如前成骨细胞和队形细胞。而骨髄来源的细胞则 可能包含骨祖细胞或更原始的基质干细胞。无论采取何 种方法分离细胞，早期原代培养中都会混杂夯成骨细胞 m系外的多种细胞类甩，但这并不影响原代培养模型的 应用。原因是①经过一段时间特定条件下培养，特別是 经过传代培养后，细胞群体趋向于单一成骨细胞系，几乎 所有细胞衣达成骨细胞特异性标志物，如碱性磷酸酶；② 多项研究表明，应用原代培养体系所得出的实验结来稳 定，重复性好◊应用伢髄基质细胞诱导来源的成骨细胞 更可反映成骨细胞分化过程各阶段特征，是观察分析成 付细胞演变的较好模咽

(三）   培养条件

1.培养基诗培养坫早使用的商品化培养基是I3GJ 培养基S前常用的培养基包括EMEM、DMEM和 MEM等，细胞系培养时亦:Ti使用培养基。

2.  白蛋白和血清 d蛋Cl可与脂类、激素和阳离子 共聚因子等结合，其对骨合成代谢的促进作用可能就是 通过与某些低浓度细胞因子结合而实现的。此外，白蛋 白还可与钙离子及其他金属离子结合。2 mg/mL牛血淸 白蛋白楚培养基中较理想浓度。血淸可提供除白蛋白外 其他培养基中缺失或含童较少的养分，一般认为，原代成 骨细胞培养中10%〜15%胎牛血淸是较恰当浓度。

3.  其他添加剂

1.  抗坏血酸（VitC) VitC是肽基羟化酶和赖氨酸 羟化酶的协同因子，在胶顶蛋白合成中发挥重要作用。 VitC在成骨细胞培养中的作用主要包括：①促进脯氨酸 羟化，从而加快丨铟前胶原蛋白合成；②促进碱性磷酸觴 活性；③促进Vitl)和视黄酸对成骨细胞分化的调节作 用；④通过促进DNA合成促进成骨细胞增生。培养基中 加人50~100 _Mg/mL VitC即可发挥最大效能。

2.  碑酸甘油外源性加人10mM有机磷p-磷 酸甘油是成付细胞堵养中常用方法。P-磷酸甘油是碱 性磷酸酶作用底物，而醎性磷酸酶可通过促进钙磷沉积, 促进细胞间质钙化。研究发现，在成骨细胞培养中加人

磷酸甘油后，X-ray显示细胞外基质矿化结品增大， 外形尖锐，但目前其具体机制尚不淸楚。

二、细胞培养中的成骨细胞鉴定（Identifica­tion of osteoblasts in cultured cells}

(一）   形态学观察

相差M微镜下观察体外培养成熟成#细胞呈扁平或 立方形态，细胞核较大呈阅形或椭圆形，早期呈单层附荦 生长，细胞亩集后多交*排列，形成多层形态。细胞外基 质逐渐丰富，m盖连接细胞间隙.并形成多个散在小结样 结构，称为骨样结节（bone nodu丨es)。骨样结节是细胞外 基质钙化产物，应用von Kossa方法染色证实，#样结节 中钙离子可被银离子置换，氧化后呈棕黑色斑块。骨样 结节亦可应用其他染色方法（如Alizon Red等）确认。

扫描电镜和透射电镜下观察成骨细胞培养中细胞外 基质表现为特征性胶原纤维交叉排列，部分胶原纤维上 有结节沉积，电镜引导下离子分析显示该处为钙离子。 X-ray衍射M示骨样结节与羟磷灰石结构相同，提示体 外形成的骨小节与体内骨结构相似。

(二）   蛋白水平成骨细胞标志物检测

目前已发现成骨细胞具有许多特征性标志物，如I 沏胶原蛋白、碱性磷酸觭、#连蛋白，骨桥蛋白和骨钙索 等。在成骨细胞生化检测中应用的最广泛标志物是碱性 磷酸醻。经典的检测细胞碱性磷酸酶活性的方法是采用 对硝基苯牌酸（p - nitropheny丨phosphate)作为底物，细胞 经超声破膜后，细胞内液与底物反应，在405mn读取吸 收光度，与总蛋白童或单位细胞数对比后可以计箅出碱 性磷酸鲔活性。I型胶原蛋白可以采用放射性标记法检 测其百分含S,另外，SDS电泳的用来测定细胞培养屮胶 原的类型。电泳方法可以检测到除I型以外的其他类型 的胶原蛋白，成熟成骨细胞只分泌I沏胶职蛋d,如有n

型和丨丨丨型胶原蛋白存在可以分别表明培养中含有软钟 细胞和成纤维细胞，

免疫学方法已广泛应用于成骨细胞标志物的检测。 应用特异性抗体，坷以针对1型胶原蛋白、碱性磷酸酶、 骨钙蛋白等进行组织化学或荧光免疫定位观察，也可应 用Wesiern blot进行定«分析。

(三）核酸水平成骨细胞标志物检測

在成骨细胞培养过程中，应用原位杂交和RNA提取 等技术可以检测成骨细胞相关基因的表达。细胞总 RNA或mRNA提取后，可以对所有己知标志物，如I型 胶原蛋白、碱性磷酸酶、骨连蛋白、骨桥蛋白和骨钙索等 采用Northern bbt进行定撮分析。反转录一聚合酶链反 应（RT-PCR)或原位PCR方法可以对数目极少的细胞 和微S标本进行半定量分析，扩展了测定的灵活性和敏 感性。

总之，成骨细胞培养目前已经成为一个在骨生物学 中符遍接受和广泛应用的技术。应用此项技术为研究成 廿细胞发生、发展极其各阶段调控机制提供了大M的数 据，是在细胞和分子水平研究各种骨代谢相关激素、细胞 因子以及药物作用的有效方法。成骨细胞培养技术仍在 发展，其方向可能包括：①在体内或体外联合应用基因 转染和敲除技术，使细胞在设定条件下生长，观察相关因 素变化；②细胞培养在组织修复过程中的应用和作用。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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