成都华西华科研究所分析蛋白组学技术用于骨质疾病方法与QCT骨密度软件体模检测
方法

1.  样品制备胰酶消化细胞，用不含血淸的培养液 中和胰酶，收集细胞离心，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，加 人蛋白质酶抑制剂和细胞裂解液（8 moI/L尿素、4% CHAPS、40 m mol/ITris),液》冻融 3 次，加人 RNA 酹和 DNA脒消化核酸，肉心（12 000 f；,30 min)收集上淸，得到 细胞总蛋白质。

2.  蛋白质含S测定将蛋白质定世标准（Albumin standard)梯度稀释后用考马斯亮蓝G- 250染色，波长 595 run测定吸收度，做标准曲线.样品稀释1〇〇倍测定 浓度。

3.  荧光标记蛋白质将Cy2, Cy3, Cy5从-20 t：

取出，室温放置5 min,加人25；zL二甲基甲酰胺，涡旋混 匀30 s,离心（12 000 g，30 s)，取出2 加人到3 pL二 甲基甲酰胺中，配制成工作液。将蛋内质样品渊节pH 为8.5,正常细胞蛋白质100丨ig用2  Cy3标记，实验处

理细胞的蛋白质lOOpg用2 Cy5标记，正常细胞和实 验处理细胞的蛋白质各50 混匀后用2 /xL Cy2标记， 冰浴中反应30 min,加入2 赖氨酸（10 m mol/L)中和 未反应的荧光，冰浴10 min，加人相N体积的2倍缓冲液 (8 mol/L 尿素、2% Pharmalytes3 - 10、2% DTT、4% CHAPS),冰浴10 min,然后加人DT丁和IPG缓冲液制 成450 /iL的一向等电聚焦体系^t51。

4.  第一向等电聚焦分别取正常细胞和实验处理 细胞的蛋白质制成一向等电聚热体系.采用胶内泡涨方 法，样品和泡涨液（8 mol/丨成素、2% CHAPS、20 m mol/L DTT、0.5% IPG缓冲液、痕馕溴酚蓝〉共45CVL,揭下 IPG胶条的保护腴，胶面甸下，先将IPG胶条尖端朝标准 甩胶条槽的尖端方向放人胶条梢中，慢慢下压胶条，并前 后移动，避免生成气泡，最后放下1PG胶平端，使溶胀液 沒®®个胶条，从丨PG胶条两鲥加入丨mmobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子.将胶条槽放置于等电聚焦上，注意电 极接触ft好，设苗等电聚焦参数：30 V, 12 h;200 V，1 h; 500 V,1 h: 1 000 V, 1 h; 8 000 V，9 h•—向等电聚焦结 束时参数为：38;xA，78 000 VhrS^[61。

5.  笫二向SDS电泳 1PG胶条平衡2次，每次15 min.平衡缓冲液包括6 md/L尿素和30%甘油，可减少 电内渗，有利于蛋白质从第一向转移到笫二向的转移.第 二次平衡步骤中加人260 mmol/L碘乙酰胺，以除去多余 的DTT.平衡后的胶条用去离子水润洗后，将胶条的边 缘置于滤纸上几分钟，以除去多余的平衡缓冲液.将丨PG 胶条小心的放置于第二向制好的SDS胶上，并轻压使 IPG胶条与SDS胶充分结合.注意胶面之间不能冇气泡， 用0.5%琼脂糖封顶，进行二向电泳，二向电泳参数为：80 mA, 40 min;调至120 mA,到溴酚蓝染料迁移到胶的底 部边缘结束电泳。

6.  染色与扫描

1.  考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色液（0.1%考 马斯亮蓝、50%甲酵、10%冰醋酸）染色6 h,考马斯亮蓝 脱色液(25%乙醉、8%冰醋酸）脱色12 h。

2.  硝酸银染色固定液（乙醉40%、冰醋酸10%) 中固定30 min,增敏液（乙醉30%、戊二醛1.25%、硫代 硫酸钠0.2%、醋酸钠6.8%)中反应30 min,双蒸水冲洗 3次，每次5 min,在硝酸银染色液（硝酸银2.5%、甲醛

[16]    4%)中温育20 min,双蒸水冲洗2次，每次1 min,M 色液（碳按钠2.5%、甲® 0.2%)中显色2 min,立即用 1.5%乙二胺四乙酸的终止液终止反应。双蒸水冲洗3 次，每次5 min,用20%的甘油保存液保存⑴。

3.  凝胶扫描分析考马斯亮蓝或硝酸银染色的凝 胶用 Image Scanner 扫描仪扫描，Imagemaster 2D Elite 4. 01图像分析软件，Imagemaster 2D Database数据库软件

分析电泳结果_u

荧光标记的凝胶用Typhoon 9410扫描仪扫描，设定 丁值为 600，用 Decyder Different丨al in - gel Analysis Version 4.00.06 和 Biological Variation Analysis 图像分析 软件分析电泳结果，蛋白质点选择的标准为峰斜度小于 1.30,峰面积大于270,峰髙度大于940。

(四〉蛋白组学技术用于骨质疾病研究的

实例

Behnam K等用4M盐酸胍和0.5M氣化钙提取去除 矿物骨中的蛋白质.用二向电泳技术将蛋白质分离，在 分子M 20KD处有两个蛋白质点，其等电点为7.85和 7.42,质谱鉴定后确定为B-晶状体球蛋白，在造骨样细 胞中也发现B-晶状体球蛋白，B-晶状体球蛋白在保 护造骨细胞的细胞钟架免受机械损伤方面有重要作 用"*】。

用差异蛋白质组学技术分析风湿性关节炎和钟关节 炎病人滑液和血浆中的蛋白差异发现：纤维蛋白片段在 所有类型关节炎的滑液中存在,calgramiHri只存在风湿性 关节炎的滑液中，血淸淀粉样蛋白A只存在于风湿性关 节炎的滑液和血浆中，这些蛋白可作为疾病的标志物考 察关节炎的类沏和发病状态^[~。

在骨质疏松症的研究中，从#组织中分离骨细胞十 分凼难，而建立终末细胞的细胞株更难，1996年，Bodine 建立的HOB-01 -C丨细胞株是目前研究骨细胞的较好 材料，其形态特点是有较多的细胞树状突起，ALP活性 低，但表达的#钙索表面标志物CD44憊很高。我们用 这一细胞株建立了研究骨质疏松症蛋白质组的技术平 台，并比较了三色荧光标记蛋白质组学技术与硝酸银和 考马斯亮蓝染色的技术的差别，为以后研究莫定了基础。

骨质疏松症的发病机制与细胞生长因子（转甩生长 因子、成纤维细胞生长因子、骨形态形成蛋白、瘦索、骨桥 素.狭岛家样生长因子、护骨索/NF-icB活化因子受体/ NF-kB活化因子受体配体系统〉、内分泌/旁分泌激索 (甲状旁腺素、降钙素、类固醉激家、维生素D)、基质金厲 蛋白嗨、碱性磷酸稱、矿物质等有关。其治疗药物有钙制 剂、氟制剂、二膦酸盐、雌激素、利尿剂等。将蛋白质组学 技术用于骨质疏松症的研究，将有助于阐明骨质疏松症 的发生、发展机制、鉴定新的药粑，以及新的生物标志物， 并用于指导临床试验。

四、基因芯片技术用于骨质疏松症的研究 (Gene - chip techniques applied in osteoporosis model)

基因芯片（Genechip)又称DNA芯片（DNA Chip)、 DNA微阵列（DNA microarray),是生物芯片技术中发展 最成熟和最先实现商品化的领域。基因芯片是基于核酸 互补杂交质理研制的◊和日常所说的计算机芯片非常相 似，在尚相基质上高度集成的不是半导体管，而是成千上 万的呈网格状密集排列的基因探针^[201。待分析样品通 过与芯片中已知碱基顺序的DNA片段互补杂交，从而确

定样品中的核酸序列和性质，对基因衣达的虽及其特性 进行分析。

(一）基因芯片技术的研究进展

根据芯片栽体中的探针败里，生物芯片可分为高密 度芯片和中低密度芯片。高密度生物芯片主要包括通过 原位合成技术制备的寡核苷酸芯片，以及部分通过将数 万个基因或EST序列的PCR扩增产物直接点至芯片中 制备的cDNA芯片。芯片中探针点数从几万至近百万， 主要用于大规携基因表达进测定，在基因功能研究、药物 筛选和新药开发等方面有着巨大的作用潜力^[21]。国外 中低密度生物芯片主要是通过合成后点样制备而成的寡 核苷酸芯片。通过将基因或EST序列的PCR扩增产物 直接点至芯片中制备成cDNA芯片，或者将抗原或抗体 配基直接点至芯片中制备成蛋白芯片。芯片中探针数目 从几十至几千不等。中低密度芯片主要用于按功能分类 的基因表达讲分析、基因突变检测或特异性抗原抗体检 测等领域

目前，比较成熟的产品冇检测基因突变的基因芯片 和检测基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片在药 学研究中可发现药物的作用粑标，致毐机制和耐药机制。 选择合适的靶标是药物筛选乃至定向合成的关键因索之 一。基因芯片可以通过比较正常组织（细胞）及病变组织 (细胞）中大里相关基因表达的变化，从而发现一组疾病 相关基因作为药物筛选的靶标，这种方法尤其适合于病 因复杂或尚未定论的情况。其基本原理是：用不同的荧 光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分 别标记成不同的探针，将探针混合后与芯片上的基因进 行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这呰基 因在不同组织或细胞中的表达谌，枵通过计算机分析出 这些基因在不同组织中表达差异的重要信息，从而可以 确定与疾病相关的基因。华盛顿大学的分子生物学系与 病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化他们 将5766个基因探针固定于芯片上，其中的5376个分别 选自卵巢癌、卵1表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文 库中；另外，还有342个来自EST克隆，包括一些已知确 定的看家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受 体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿惟相 关基因。对卵巢组织及卵巢痛组织的mRNA进行分析， 发现两者之间有30%的mRNA表达水平表现出2倍差 别，9%的mRNA表达水平表现出3倍以上的差别。根 据这些差别，研究小组从中挑选出726个cDNA作进一 步的测序和比较分析，找出在卵巢癌组织中过度表达和 低表达的30个基因，其中上调较为明显的有CD9、上皮 糖蛋白、P27及HE4蛋白激酶抑制物等，这些研究结果有 助于研究肿瘸发展过程中参与的分子机制及寻找肿瘤诊 断和治疗的耙分子。Derisi等应用cDNA芯片检测了肿 痼抑制相关基因的表达^(25]。他们把正常人6号染色体 转导入人黑色索瘤细胞株，该瘤的致病性被抑制。用 cDNA芯片检测两株细胞的基因表达，几个表达有显著 差异的基因被认为决定了黑色素细胞致瘤的表型特征，

这呰能改变自身表达并能使肿瘤抑制的暮闵可作为治疗 粑。这一技术也被用于炎症疾病，如风湿性关节炎和肠 炎的特异性基因表达研究◊ Heller等应用该技术对风湿 性关节炎病变细胞和正常细胞间基因表达的差异进行了 研究^[261，发现一些与炎症相关的新基因并经对风湿性关 节炎和炎性肠道疾病的组织比较确证了 1L一 3、趋化因 子Cro— a、金属蛋白酹基质的胰肽觭与这两种疾病的新 关系，从这两种疾病的末梢血库得出的信息也揭示了金 属蛋白《—1的组合子抑制物、铁蛋白的轻链和锰超氧 化物歧化酶的基因表达有M著性差异。

(二）  方法

7.  反转录荧光标记cDNA杂交探针以总RNA为 模板，用Cy3/5dUTP掺人合成cDNA第一链。反转录反 应为：

总 RNA 70

OligodT16(0.5_Mg//iL)  5 tiL

混匀后立即70t：热变性lOmin,冰浴2min后依次 加人：

5 x RT buffer 5

O.lmol-1- 1 DTT 2.5 fiL

RNasin(40 U/^L) 1.0 fxL

dNTP Mix( 1 mmol/L) 1 //L

Cy3/5-dCUP (1 mmol/L)  1

Superscript II reverse transecripase (200U//iL)l 用Q纯水（0.1% DEPC处理）定容至25yL。混匀 后42 t：水浴反应2 h。

反转录反应完毕后，整个体系于70 T：水浴15 min 灭活反转录酶；加人NaOH,并于65 t：水浴30 min降解 RNA;最后冰浴条件下加人盐酸中和，加入冰浴的无水乙 醉沉淀cDNA。1%琼脂糖电泳鉴定反转录产物。最后 产物溶于3XSSC杂交液中条用。

8.  芯片的杂交和洗涤制备好的芯片依次用0.2% SDS溶液洗涤约1 min,纯水洗涤0.5 min,室温无污染晾 干。在芯片点样区上方覆盖适当大小的盖玻片。将己溶 解的cDNA杂夂探针在96 X：水浴变性2 min后立即冰 浴。将HFCL细胞RNA的反转录产物cDNA与加药细 胞的cDNA进行等致混合，按约2 pL/cm²的里转移到芯 片上，利用盖玻片与栽玻片之间的毛细现象使溶液均匀 平铺。芯片置于杂交盒中42 t：杂交3 h。芯片杂交完 毕，室温下依次用洗液A(1 XSSC,0.2% SDS)，洗液B (0.2X SSC)，洗液C(0. 1 x SSC)梯度洗片，然后室温 干燥。

9.  芯片的扫描与数据处理分析用双波长激光共 聚焦荧光扫描仪GcncPix4000B扫描芯片，Cy3、Cy5激发 波长为530 rnn，检测波长分别为585和650 mn。经软件 lmagene3.0(Biodiscovery Inc)或 GenePix Pro 进行图像数 据转换，获得信号值及差异比值_u

(三）  基因芯片技术用于骨质疾病研究的实例 骨形态形成蛋白（bone morphogenitic proteins, BMP)

最初是由Urist等从成年人骨中提取到的一种活性蛋白 质，因具有诱导骨外组织发生软骨内成骨而得名。BMP 是骨组织中调节骨发育和骨代谢的重要细胞因子，但在 其他组织中也有广泛的生理作用，BMP在胚胎发育、器 官形成中的重要作用日益为人们所认识。

Vaes等用基因芯片技术筛选受BMP调节的间充质 干细胞的靶基因，共获得9596个序列，342个相关基因 和表达序列标记，这些基因可分为细胞分化早、中、后三 期的反应性基因簇，与成骨细胞相比较，发现9个新的分 化后期的反应基因（其中包括Wm抑制因子基因）^[27]。 Dejong等用基因芯片技术也测定了受BMP、TGF 和活化素调节的15个细胞早期分化的目的基因^l28i。 在早期胚胎发育时，BMP指导身体基本形态的形成，并 在特定部位诱导形成特异组织。

将BMP注射到小鼠骨四头肌内，用基因芯片技术发 现122个与骨和关节代谢相关的基因如cytokine receptor -like factor - 1 (Crlfl) and matrix metalloproteinase 23 (Mm_P23)等上调，这些基因在骨和关节发育中起重要作 用^[291〇成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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